Gevoeligheid en toepassingen van de PCR Single-Strand Conformation Polymorphism-methode

PCR Single-Strand Conformation Polymorphism is een methode die wordt gebruikt om mutaties te identificeren en te detecteren en staat nu bekend om zijn vele toepassingen op levende wezens. Dit artikel bespreekt de experimentele particulars, beperkingen en gevoeligheid van de PCR Single-Strand Conformation Polymorphism-methode in relatie tot alle bestaande literatuur die tot op heden beschikbaar is. Genomische DNA-extractie, PCR-amplificatie en enkelstrengs conformatie Polymorfisme-omstandigheden (concentratie van polyacrylamide-slabgelelektroforese, dissociatiebehandeling van dubbelstrengs DNA) en vergelijking met PCR- restrictiefragmentlengtepolymorfisme worden gepresenteerd.

Sinds de ontdekking in 1989 zijn er veel variaties, innovaties en modificaties van de methode geweest, waardoor het zeer gemakkelijk, veilig, snel en om deze reden op grote schaal wordt toegepast in klinische diagnostiek, forensische geneeskunde, biochemisch, veterinair, microbiologisch, voedsel en milieu laboratoria. Een van de mogelijke toepassingen van de methode is de diagnose en identificatie van mutaties in nieuwe stammen van coronavirussen, omdat de wetenschap meer instrumenten nodig heeft om het probleem van deze pandemie aan te pakken. De PCR Single-Strand Conformation Polymorphism-methode kan in veel gevallen worden toegepast, op voorwaarde dat er controlemonsters beschikbaar zijn en de vereiste voorwaarden van de methode worden bereikt.

Beheer van pediatrische niet-pathogene bloedculturen na introductie van PCR-technologie

Achtergrond:  De snelle identificatie van organismen gerapporteerd in positieve bloedkweken through polymerasekettingreactie (PCR) kan een niet-pathogene bacterie nauwkeurig identificeren en de tijd tot definitieve identificatie verkorten in vergelijking met traditionele microbiologische methoden. Hoe deze technologie de klinische en antimicrobiële behandeling beïnvloedt bij kinderen met niet-pathogene bacteriën die zijn geïdentificeerd in een bloedkweek zonder beslissingsondersteuning, is niet geëvalueerd.

Methoden:  Een retrospectieve studie van de behandeling van kinderen met positieve bloedkweekresultaten voor niet-pathogene organismen voor en na implementatie van PCR-technologie. Het antibioticumbeheer van elk cohort, de frequentie van herhalingsculturen en terugkeerbezoeken aan een afdeling spoedeisende hulp (ED) werden vergeleken.

Resultaten:  Een totaal van 136 patiënten gedurende deze periode (49% [ n  = 67] pre-PCR en 51% [ n  = 69] post-PCR) hadden een bloedkweek die positief was voor niet-pathogene bacteriën. Toegelaten patiënten kregen minder vaak een tweede exemplaar voor onderzoek opgestuurd ( P  = .04); de totale blootstelling aan antibiotica verschilde echter niet important ( P  = .3) na introductie van PCR-technologie. Er was geen important verschil in verblijfsduur na de interventie ( P  = 0,12 ). Patiënten die direct van de SEH werden ontslagen, hadden minder nabezoeken ( P  = .02) en kregen minder herhaalde bloedkweken ( P = .04), en antibiotica werden minder vaak toegediend na terugkeer ( P  = .04) na introductie van PCR-technologie.

Conclusies:  Met de toevoeging van PCR-technologie kregen patiënten met bloedkweken die positief waren voor niet-pathogene bacteriën minder antibiotica, minder herhaalde bloedkweken en minder herhaalde ED-evaluaties.

Een nieuwe methode om binaire CRISPR-vectoren te construeren voor plantentransformatie door een enkele ronde van PCR-amplificatie

CRISPR/Cas9 is een gevestigde en flexibele software voor genoombewerking. De meeste methoden die worden gebruikt om expressieklonen voor de CRISPR/Cas9 te genereren, zijn echter tijdrovend . Daarom hebben we een eenstapsprotocol ontwikkeld om sgRNA-expressiecassette (s) rechtstreeks in binaire vectoren te introduceren (Liu  et al. , 2020). In deze benadering hebben we de multiplex-PCR geoptimaliseerd om een ​​overlappend PCR-product te produceren in een enkele reactie om de sgRNA- expressiecassette te genereren .

We hebben ook twee sgRNA-expressiecassettes geamplificeerd door een enkele PCR-ronde. Vervolgens worden de sgRNA-expressiecassette(s) in de binaire vectoren gekloneerd in een Gateway LR- of Golden Gate-reactie. Het hier gerapporteerde systeem biedt een veel efficiëntere en eenvoudigere process om expressieklonen te construeren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking. In dit protocol beschrijven we de gedetailleerde stapsgewijze instructies voor het gebruik van dit systeem.

Detectie en kwantificering van  EGFR  T790M-mutatie in vloeibare biopsieën door middel van digitale druppel PCR

Achtergrond:  Vloeibare biopsie maakt de identificatie van doelgerichte kankermutaties op een minimaal invasieve manier mogelijk. Bij patiënten met gevorderde niet-kleincellige longkanker (NSCLC) wordt druppel digitale PCR (ddPCR) in toenemende mate gebruikt om het epidermale groeifactor receptor ( EGFR ) gen in circulerend celvrij DNA (cfDNA) te genotyperen. De gevoeligheid van deze methode staat echter nog ter discussie. Het doel van deze studie was het implementeren en beoordelen van de prestaties van een ddPCR- assay voor het detecteren van de  EGFR  T790M-mutatie in vloeibare biopsieën.

Methoden:  Een ddPCR-assay werd geoptimaliseerd om de EGFR  T790M- mutatie te detecteren  in plasmamonsters van 77 patiënten met NSCLC in progressie.

Resultaten:  Onze ddPCR-assay maakte de detectie en kwantificering van de  EGFR  T790M- mutatie mogelijk bij een cfDNA-allelfrequentie van slechts 0,5%. De mutatie werd gedetecteerd in 40 plasmamonsters, wat overeenkomt met een positiviteitspercentage van 52%. Het aantal mutante moleculen per ml plasma varieerde van 1 tot 6.000. Bij 12 patiënten met een negatieve plasmatest werd een herbiopsie geanalyseerd en in 2 gevallen werd de mutatie gedetecteerd. Bij 6 patiënten werd een tweede vloeibare biopsie uitgevoerd en in Three gevallen werd de mutatie gedetecteerd.

Conclusies:  Deze studie benadrukt de waarde van ddPCR voor het detecteren en kwantificeren van de  EGFR  T790M-mutatie in vloeibare biopsieën in een echte klinische setting. Onze resultaten suggereren dat herhaalde ddPCR-tests in cfDNA weefselherbiopsie kunnen voorkomen bij patiënten die niet in staat zijn een tumorweefselmonster te leveren dat geschikt is voor moleculaire analyse.

 

Een snelle en gevoelige fluorescentiebiosensor op foundation van plasmonische PCR

Plasmonische PCR die gebruik maakt van metalen nanodeeltjes heeft grote voordelen opgeleverd in vergelijking met de commerciële thermocycler-apparatuur in termen van kosten, grootte en verwerkingstijd . Vanwege de sterke fluorescentie-uitdoving vereist op plasmonische nanodeeltjes gebaseerde PCR echter aanvullende nabewerkingsstappen zoals centrifugatie en gelelektroforese. Dit proces verlengt de totale diagnostische tijd en compenseert de voordelen van snelle thermocycling. Hier rapporteren we een snelle en gevoelige plasmonische fotothermische PCR (PPT-PCR) testmethode op foundation van in situ eindpunt fluorescentiedetectie.

Door gebruik te maken van plasmonische magnetische bifunctionele nanodeeltjes, heeft PPT-PCR met 30 thermocycli en fluorescentiedetectie na magnetische scheiding met succes aangetoond dat DNA-doelen binnen 5,5 minuten kunnen worden gedetecteerd. De detectielimiet (3,Three kopieën per μL) is vergelijkbaar met die van de conventionele real-time kwantitatieve PCR; de testtijd is echter ongeveer 5,5 keer korter voor de PPT-PCR. De strategie om het fotothermische impact en magnetische scheiding in een enkel deeltje te combineren, zal nieuwe horizonten openen in de ontwikkeling van snelle en gevoelige PCR-gebaseerde biosensoren voor point-of-care-testen.

Comorbiditeit en leeftijd worden in verband gebracht met aanhoudende COVID-19 PCR-positiviteit

Doelstellingen:  De impression van demografische gegevens en comorbiditeiten op de duur van de positiviteit van de COVID-19 nasofaryngeale uitstrijkje PCR blijft onduidelijk. Het doel van onze analyse is om de impression te bepalen van leeftijd, opname op de intensive care (IC), comorbiditeiten en etniciteit op de duur van COVID-19 PCR-positiviteit bij gehospitaliseerde patiënten in een grote groep ziekenhuizen.

Methode:  We bestudeerden 530 patiënten uit een groot ziekenhuissysteem en de tijd tot SARS-CoV-2- virus RNA PCR-negativiteit op elk second tijdens ziekenhuisopname of na ontslag uit het ziekenhuis was het primaire eindpunt. We includeerden patiënten van 18 jaar of ouder die tussen 1 februari 2020 en 14 april 2020 positief testten op COVID-19 tijdens een bezoek aan een ziekenhuis, polikliniek of spoedeisende hulp.

Resultaten: in  totaal hadden 315 (59,4%) van onze patiëntenpopulatie Four weken na de eerste positieve take a look at nog steeds een positieve SARS-CoV-2-virus-RNA-PCR. We vonden dat leeftijd> 70 jaar, chronische nierziekte, hypertensie, hyperlipidemie, obesitas of coronaire hartziekte geassocieerd zijn met aanhoudende PCR-positiviteit gedurende meer dan Four weken na de eerste diagnose.

Conclusie:  Bij het interpreteren van een positieve COVID PCR-test moet rekening worden gehouden met leeftijd en de aanwezigheid van comorbiditeiten.