Zapalenie wymienia u bydła jest najważniejszym źródłem strat dla przemysłu mleczarskiego. Szybki i specyficzny test do wykrywania głównych patogenów zapalenia wymienia u bydła nie jest aktualnie dostępny. Opracowano sondy molekularne reagujące w reakcji  PCR  z bakteryjnym DNA z mleka krowiego, zapewniające  bezpośrednie  i szybkie wykrywanie Escherichia coli , Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis oraz Streptococcus uberis.

Dla każdego z tych mikroorganizmów zaprojektowano dwa zestawy specyficznych starterów, które wydawały się rozróżniać bliskie filogeniczne gatunki bakterii (np. S. agalactiae i S. dysgalactiae). Ponadto zaprojektowano dwa zestawy uniwersalnych starterów, które reagują jako kontrole pozytywne ze wszystkimi głównymi patogenami zapalenia wymienia u bydła.

Porównano czułość testu z użyciem DNA S. aureus wyekstrahowanego z mleka zi bez etapu lizy  enzymatycznej  komórek  bakteryjnych przed PCR . Granica wykrywalności testu wynosiła 3,125 x 10(2) CFU/ml mleka, gdy DNA S. aureus zostało wyekstrahowane za pomocą etapu enzymatycznego przed PCR  , w porównaniu z 5 x 10(3) CFU/ml mleka przy braku  etap enzymatyczny przed PCR .

Ten ostatni próg czułości jest nadal zgodny z jego zastosowaniem jako skutecznym narzędziem diagnostycznym w zapaleniu wymienia u bydła, pozwalającym na eliminację drogich  odczynników . Te dwa  testy PCR  pozwalają uniknąć uciążliwych i długich etapów hodowli, można je przeprowadzić w ciągu kilku godzin i są czułe, specyficzne i niezawodne w  bezpośrednim  wykrywaniu w mleku sześciu najbardziej rozpowszechnionych bakterii powodujących zapalenie wymienia u bydła.

Test szybkiej  bezpośredniej  amplifikacji kwasów nukleinowych bez ekstrakcji RNA dla SARS-CoV-2 przy użyciu przenośnego  termocyklera do PCR .

Trwa ogólnoświatowa pandemia choroby koronawirusowej 2019 (Covid-19) spowodowana przez koronawirus 2 zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2). Obecnie diagnoza potwierdzająca opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT – PCR ), zwykle trwającą kilka godzin i wymagającą laboratorium molekularnego.

Istnieje pilna potrzeba szybkich, uproszczonych i opłacalnych metod wykrywania. Opracowaliśmy i poddaliśmy walidacji analitycznej protokół do  bezpośredniego wykrywania SARS-CoV-2 metodą  szybkiej, wolnej od ekstrakcji  metodą PCR  ( DIRECT – PCR ) bez konieczności oczyszczania kwasu nukleinowego.

Tylko sześć kopii RNA na reakcję genu nukleokapsydu wirusa (N) z próbek oddechowych, takich jak plwocina i wysięk z nosa, można wykryć  bezpośrednio za pomocą naszego jednoetapowego testu odporności na inhibitor.

Wydajność tego testu została zwalidowana na dostępnym w handlu przenośnym   termocyklerze PCR . Lizę wirusa  , odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję uzyskuje się w jednoprobówkowej jednorodnej reakcji w ciągu 36 minut.

Minimalizuje to czas pracy, skraca czas przygotowania próbki do wyniku i eliminuje potrzebę stosowania  odczynników do oczyszczania RNA . Mogłoby to umożliwić szersze wykorzystanie testów Covid-19 do diagnozy, badań przesiewowych i badań w krajach i regionach, w których możliwości laboratoryjne są ograniczone.

Specyficzne wychwytywanie i wykrywanie Staphylococcus aureus za pomocą zmodyfikowanych aptamerów o wysokim powinowactwie do składników powierzchni komórki.

Odczynniki zmodyfikowanego aptameru o powolnej dysocjacji (SOMAmer)   wytworzono dla kilku białek związanych z powierzchnią komórki Staphylococcus aureus za pomocą SELEX z wieloma zmodyfikowanymi bibliotekami DNA przy użyciu oczyszczonych białek rekombinowanych lub natywnych. Czynniki wiążące o wysokim powinowactwie z subnanomolarnymi Kd’s otrzymano dla gronkowcowego białka A (SpA), czynników zlepiających (ClfA, ClfB), białek wiążących fibronektynę (FnbA, FnbB) i regulowanych przez żelazo determinant powierzchniowych (Isd). Dalsze badania przesiewowe ujawniły kilka SOMAmerów, które specyficznie wiązały się ze Staph. komórki złocistego ze wszystkich testowanych szczepów, ale nie z innymi gronkowcami lub innymi bakteriami.

SoMAmery SpA i ClfA okazały się przydatne do selektywnego wychwytywania i wzbogacania Staph. komórki aureus, jak wykazała hodowla i  PCR , co prowadzi do poprawy granic wykrywalności i skutecznego usuwania   inhibitorów PCR . Wykrywanie gronkowca. komórki aureus zostały wzmocnione o kilka rzędów wielkości, gdy powierzchnię komórki bakteryjnej pokryto SOMAmerami, a następnie przeprowadzono qPCR  SOMAmerów.

Ponadto znakowane fluorescencyjnie SOMAmery SpA wykazały swoją użyteczność jako  bezpośrednich  środków wykrywających w cytometrii przepływowej. Znaczenie i wpływ badania: Monitorowanie skażenia mikrobiologicznego żywności, wody, produktów niesterylnych lub środowiska zazwyczaj opiera się na kulturze,  reakcji PCR  lub przeciwciałach.

Aptamery, które wiążą się z wysoką swoistością i powinowactwem z dobrze konserwowanymi epitopami na powierzchni komórki, stanowią obiecujący nowy rodzaj  odczynników  do wykrywania komórek bakteryjnych bez potrzeby hodowli lub  lizy komórkowej , w tym do wychwytywania i wzbogacania bakterii obecnych w niskich gęstościach komórek oraz do bezpośrednie   wykrywanie poprzez qPCR lub barwienie  fluorescencyjne.

Optymalizacja  bezpośredniej lampy RT-LAMP w celu wykrywania pasażowalnego SARS-CoV-2 z pierwotnych próbek wymazów z nosogardzieli.

1. Testy SARS-CoV-2 mają kluczowe znaczenie dla kontrolowania rozprzestrzeniania się tego wirusa, jednak niedobory zasobów do ekstrakcji kwasu nukleinowego i innych kluczowych  odczynników  utrudniły reakcję na COVID-19 w USA.
2. Kilka grup opisało pętlowe testy izotermicznej amplifikacji (LAMP) dla SARS-CoV-2, w tym testowanie  bezpośrednio z wymazów z nosogardzieli i eliminację potrzeby   braku odczynników .
3. Częste monitorowanie osób uczęszczających do pracy lub szkoły jest obecnie niedostępne dla większości ludzi, ale prawdopodobnie będzie konieczne, aby zmniejszyć ~50% transmisji, która występuje u osób bezobjawowych.
4. W tym miejscu opisujemy fluorescencyjny test RT-LAMP przy użyciu  bezpośrednich  próbek wymazów z nosogardzieli i wykazujemy spójne wykrywanie w klinicznie potwierdzonych próbkach pierwotnych z limitem wykrywalności (LOD) wynoszącym ~625 kopii/μl, około 100-krotnie niższą czułością niż qRT- PCR .
5. Chociaż metoda RT-LAMP bez ekstrakcji RNA jest mniej czuła niż metody molekularne oparte na ekstrakcji, jest szybka i niedroga. Tutaj również pokazujemy, że dodanie   buforu  do lizy bezpośrednio do reakcji RT-LAMP poprawia czułość niektórych próbek około 10-krotnie.
6. Ponadto oczyszczony RNA w tym teście osiąga podobny LOD do qRT- PCR . Wyniki te wskazują, że wysokowydajne testy RT-LAMP mogą wzmocnić qRT – PCR  w programach nadzoru SARS-CoV-2, zwłaszcza gdy dostępność testów qRT- PCR i odczynników  do ekstrakcji RNA   jest ograniczona.

Walidacja wysokoprzepustowej metodologii analizy pojedynczych komórek.

Wysokowydajne podejścia ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (q PCR ) umożliwiają profilowanie wielu genów w pojedynczych komórkach, dostarczając nowych informacji na temat złożonych procesów biologicznych i oferując możliwości monitorowania komórek rakowych na podstawie pojedynczych komórek i terapii opartych na komórkach macierzystych. Jednak do diagnostyki klinicznej i testowania produktów inżynierii tkankowej wymagane są przepływy pracy z dobrze zdefiniowanymi źródłami zmienności.

W badaniu linii nerwowych komórek macierzystych zbadaliśmy wydajność  etapów lizy , odwrotnej transkrypcji (RT), preamplifikacji (PA) i nanofluidycznego q PCR  na poziomie pojedynczej komórki pod względem wydajności, precyzji i granicy wykrywalności. Porównaliśmy protokoły przy użyciu oddzielnego  buforu do lizy  z wychwytywaniem komórek  bezpośrednio w odczynniku RT-PA  .

Stwierdzono, że obie metody mają podobną   wydajność  lizy , podczas gdy bezpośrednie  podejście RT-PA wykazało lepszą precyzję. Zastosowano cyfrowy  PCR  do powiązania liczby wstępnie amplifikowanych kopii matrycy z wartościami Cq i ujawnienia, gdzie sygnały o niskiej jakości mogą wpływać na analizę .

Zbadaliśmy wpływ strategii kalibracji i normalizacji danych jako środka minimalizacji wpływu zmienności międzyeksperymentalnej na wartości ekspresji genów i stwierdziliśmy, że oba podejścia mogą poprawić porównywalność danych. Niniejsze badanie zapewnia walidację i wskazówki dotyczące zastosowania wysokowydajnych przepływów pracy q PCR  do profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie eksprymowanego genu w izolowanych pojedynczych komórkach w mikrokomorach nową metodą bezpośredniej reakcji gorącej komórki  RT – PCR  .

Aby móc wykryć ekspresję genu w poszczególnych komórkach, ważna jest zdolność do izolacji i lizy pojedynczej komórki oraz przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT- PCR ) w jednym urządzeniu.

Jak zwykle, podczas przeprowadzania  lizy komórek  i RT- PCR  w tej samej komorze reakcyjnej, konieczne jest dodanie  odczynnika  do RT – PCR  po  lizie komórek . W tym badaniu proponujemy oryginalną formułę  lizy komórek  i RT- PCR  w tej samej komorze reakcyjnej bez dodawania  odczynnika  jedynie w procesie ogrzewania, który nazwaliśmy bezpośrednią  RT – PCR z gorącymi komórkami . Bezpośrednia  RT – PCR z użyciem gorących komórek  została umożliwiona dzięki zastosowaniu polimerazy DNA Tth, która jest termostabilną polimerazą i ma wysoką aktywność odwrotnej transkrypcji w obecności jonów manganu. Bezpośrednią  detekcję produktów RT- PCR  przeprowadzono poprzez detekcję fluorescencji za pomocą dwubarwnikowej sondy fluorescencyjnej.

Próbowaliśmy wykryć mRNA genu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) w izolowanych komórkach Jurkat na urządzeniu mikroprzepływowym, które już opracowaliśmy do izolacji pojedynczych komórek.

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)
101-T	Cusabio	50 ml	169.2 EUR
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)
102-T	Viagen	100ml	248.4 EUR
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer
ABP-PP-MT01100	Allele Biotech	100 RXNS	Ask for price
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer
ABP-PP-MT01500	Allele Biotech	500 RXNS	Ask for price
amfiSure Direct PCR Lysis Buffer
D0300-010	GenDepot	100ml	165.6 EUR
mRNAExpress Tail PCR mix (5uM)
MR-TAIL-PR	SBI	100 ul	196.8 EUR
TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit
AST-2005	Applied StemCell	100 reactions	156.72 EUR
TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit
AST-2006	Applied StemCell	100 reactions	156.72 EUR
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit
ABP-PP-MT02100	Allele Biotech	100 RXNS	Ask for price
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit
ABP-PP-MT02500	Allele Biotech	500 RXNS	Ask for price
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)
401-E	Viagen	25 ml	169.2 EUR
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)
402-E	Viagen	50 ml	248.4 EUR
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)
301-C	Viagen	50 ml	169.2 EUR
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)
302-C	Viagen	100 ml	248.4 EUR
Plant Direct PCR Kit
PD105-01	Vazyme	50 rxn (50 μl/rxn)	202.8 EUR
Plant Direct PCR Kit
PD105-02	Vazyme	200 rxn (50 μl/rxn)	424.8 EUR
Direct PCR Complete Kit
S700	GeneOn	100 rcs	159.6 EUR
Direct PCR Complete Kit
S700-2	GeneOn	5x100 rcs	628.8 EUR
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B40013	Bimake	200 ractions	250.8 EUR
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B40015	Bimake	500 ractions	490.8 EUR
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B45012	Bimake	1ml*5 (500 ractions)	336 EUR
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B45013	Bimake	1ml*20 (2000 ractions)	1038 EUR
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer
ABP-PP-BD01100	Allele Biotech	100 RXNS	Ask for price
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer
ABP-PP-BD01500	Allele Biotech	500 RXNS	Ask for price
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free
X3100-010	GenDepot	100ml	208.8 EUR
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free
X3100-050	GenDepot	500ml	380.4 EUR
Blood Direct PCR Kit V2
PD103-01	Vazyme	50 rxn	202.8 EUR
Blood Direct PCR Kit V2
PD103-02	Vazyme	200 rxn	424.8 EUR
FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions
4615	Intact Genomics	1/EA	621.6 EUR
Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase
FYT507-100P	Yeastern Biotech	100 Preps	Ask for price
Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase
FYT507-50P	Yeastern Biotech	50 Preps	Ask for price
Mouse Helicobacter PCR kit
PCR-V346-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Mouse Helicobacter PCR kit
PCR-V346-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Mouse Adenovirus PCR kit
PCR-V366-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Mouse Adenovirus PCR kit
PCR-V366-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Mouse cytomegaloviruses PCR kit
PCR-V367-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Mouse cytomegaloviruses PCR kit
PCR-V367-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Mouse Rotavirus PCR kit
PCR-V375-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Mouse Rotavirus PCR kit
PCR-V375-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
PCR Tubes (50)
PCR-50	BioAssay Systems	50	15 EUR
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit
ABP-PP-BD02100	Allele Biotech	100 RXNS	Ask for price
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit
ABP-PP-BD02500	Allele Biotech	500 RXNS	Ask for price
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase
FYT506-100P	Yeastern Biotech	100 Preps	Ask for price
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase
FYT506-50P	Yeastern Biotech	50 Preps;	Ask for price
Mouse hepatitis virus PCR kit
PCR-V371-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Mouse hepatitis virus PCR kit
PCR-V371-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
Direct Mouse Genotyping Kit
K1025-200	ApexBio	200 rxns	142.8 EUR
Direct Mouse Genotyping Kit
K1025-500	ApexBio	500 rxns	226.8 EUR
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
PCR-MPX218-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
PCR-MPX218-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Mouse parvovirus type 1 PCR kit
PCR-V324-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Mouse parvovirus type 1 PCR kit
PCR-V324-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Lysis Buffer
abx098984-LysisBuffer120ml	Abbexa	Lysis Buffer 1 (20 ml)	184.8 EUR
Lysis Buffer
abx098984-LysisBuffer3100ml	Abbexa	Lysis Buffer 3 (100ml)	276 EUR
Lysis Buffer
abx098984-LysisBuffer420ml	Abbexa	Lysis Buffer 4 (20 ml)	184.8 EUR
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
PCR-MPX401-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
PCR-MPX401-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
ranavirus PCR kit
PCR-V337-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
ranavirus PCR kit
PCR-V337-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Ruminococcus PCR kit
PCR-V619-48D	Bioingentech	50T	510.96 EUR
Ruminococcus PCR kit
PCR-V619-96D	Bioingentech	100T	625.8 EUR
Bifidobacterium PCR kit
PCR-V621-48D	Bioingentech	50T	510.96 EUR
Bifidobacterium PCR kit
PCR-V621-96D	Bioingentech	100T	625.8 EUR
Halobacillus PCR kit
PCR-A635-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Halobacillus PCR kit
PCR-A635-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Enterovirus PCR kit
PCR-H433-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Enterovirus PCR kit
PCR-H433-96R	Bioingentech	100T	1030.8 EUR
Mengovirus PCR kit
PCR-H453-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Mengovirus PCR kit
PCR-H453-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
Astrovirus PCR kit
PCR-H491-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Astrovirus PCR kit
PCR-H491-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
Calicivirus PCR kit
PCR-H493-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Calicivirus PCR kit
PCR-H493-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
Adenovirus PCR kit
PCR-H501-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Adenovirus PCR kit
PCR-H501-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Polyomavirus PCR kit
PCR-H515-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Polyomavirus PCR kit
PCR-H515-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Ruminococcus PCR kit
PCR-H619-48D	Bioingentech	48T	543.6 EUR
Ruminococcus PCR kit
PCR-H619-96D	Bioingentech	96T	686.4 EUR
Bifidobacterium PCR kit
PCR-H621-48D	Bioingentech	48T	543.6 EUR
Bifidobacterium PCR kit
PCR-H621-96D	Bioingentech	96T	686.4 EUR
Sapovirus PCR kit
PCR-H630-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Sapovirus PCR kit
PCR-H630-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
Parechovirus PCR kit
PCR-H642-48R	Bioingentech	50T	813.6 EUR
Parechovirus PCR kit
PCR-H642-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
Metapneumovirus PCR kit
PCR-H643-48R	Bioingentech	50T	987.6 EUR
Metapneumovirus PCR kit
PCR-H643-96R	Bioingentech	100T	1335.6 EUR
Entamoeba PCR kit
PCR-H683-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Entamoeba PCR kit
PCR-H683-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Acanthamoeba PCR kit
PCR-H684-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Acanthamoeba PCR kit
PCR-H684-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
Echovirus PCR kit
PCR-H722-48D	Bioingentech	50T	543.6 EUR
Echovirus PCR kit
PCR-H722-96D	Bioingentech	100T	686.4 EUR
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)
105-540	GeneOn	20 rcs x 50 µl	196.8 EUR
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)
105-542	GeneOn	100 rcs x 50 µl	658.8 EUR
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)
105-544	GeneOn	1000 rcs x 50 µl	5026.8 EUR
EP Reagent Biuret Reagent
1011601	Scientific Laboratory Supplies	1L	42.18 EUR
EP Reagent Iodoplatinate Reagent
1046300	Scientific Laboratory Supplies	200ML	360.24 EUR
EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent
1053601	Scientific Laboratory Supplies	100ML	354.54 EUR
EP Reagent Molybdovanadic Reagent
1056700	Scientific Laboratory Supplies	100ML	42.18 EUR

 

Po izolacji komórek i kolejnym bezpośrednim  RT – PCR z gorącymi komórkami  na urządzeniu, sygnały fluorescencyjne z produktów RT – PCR  dla pojedynczej komórki zostały wykryte i odróżnione od komory nie zawierającej komórek. Wysoce dodatnią zależność liniową (r = 0,9933) zaobserwowano między liczbą komór zawierających komórki a komórkami zawierającymi produkty RT- PCR  od 10 do 400 komórek μl(-1). W ten sposób możliwe było zastosowanie nowej metody  RT – PCR opartej na gorących komórkach do wykrywania eksprymowanego  genu w izolowanych komórkach.