Opracowanie szybkiego i czułego testu do identyfikacji głównych patogenów w zapaleniu wymienia u bydła metodą PCR.

Zapalenie wymienia u bydła jest najważniejszym źródłem strat dla przemysłu mleczarskiego. Szybki i specyficzny test do wykrywania głównych patogenów zapalenia wymienia u bydła nie jest aktualnie dostępny. Opracowano sondy molekularne reagujące w reakcji  PCR  z bakteryjnym DNA z mleka krowiego, zapewniające  bezpośrednie  i szybkie wykrywanie Escherichia coli , Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis oraz Streptococcus uberis.

Dla każdego z tych mikroorganizmów zaprojektowano dwa zestawy specyficznych starterów, które wydawały się rozróżniać bliskie filogeniczne gatunki bakterii (np. S. agalactiae i S. dysgalactiae). Ponadto zaprojektowano dwa zestawy uniwersalnych starterów, które reagują jako kontrole pozytywne ze wszystkimi głównymi patogenami zapalenia wymienia u bydła.

Porównano czułość testu z użyciem DNA S. aureus wyekstrahowanego z mleka zi bez etapu lizy  enzymatycznej  komórek  bakteryjnych przed PCR . Granica wykrywalności testu wynosiła 3,125 x 10(2) CFU/ml mleka, gdy DNA S. aureus zostało wyekstrahowane za pomocą etapu enzymatycznego przed PCR  , w porównaniu z 5 x 10(3) CFU/ml mleka przy braku  etap enzymatyczny przed PCR .

Ten ostatni próg czułości jest nadal zgodny z jego zastosowaniem jako skutecznym narzędziem diagnostycznym w zapaleniu wymienia u bydła, pozwalającym na eliminację drogich  odczynników . Te dwa  testy PCR  pozwalają uniknąć uciążliwych i długich etapów hodowli, można je przeprowadzić w ciągu kilku godzin i są czułe, specyficzne i niezawodne w  bezpośrednim  wykrywaniu w mleku sześciu najbardziej rozpowszechnionych bakterii powodujących zapalenie wymienia u bydła.

Test szybkiej  bezpośredniej  amplifikacji kwasów nukleinowych bez ekstrakcji RNA dla SARS-CoV-2 przy użyciu przenośnego  termocyklera do PCR .

Trwa ogólnoświatowa pandemia choroby koronawirusowej 2019 (Covid-19) spowodowana przez koronawirus 2 zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2). Obecnie diagnoza potwierdzająca opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT – PCR ), zwykle trwającą kilka godzin i wymagającą laboratorium molekularnego.

Istnieje pilna potrzeba szybkich, uproszczonych i opłacalnych metod wykrywania. Opracowaliśmy i poddaliśmy walidacji analitycznej protokół do  bezpośredniego wykrywania SARS-CoV-2 metodą  szybkiej, wolnej od ekstrakcji  metodą PCR  ( DIRECT – PCR ) bez konieczności oczyszczania kwasu nukleinowego.

Tylko sześć kopii RNA na reakcję genu nukleokapsydu wirusa (N) z próbek oddechowych, takich jak plwocina i wysięk z nosa, można wykryć  bezpośrednio za pomocą naszego jednoetapowego testu odporności na inhibitor.

Wydajność tego testu została zwalidowana na dostępnym w handlu przenośnym   termocyklerze PCR . Lizę wirusa  , odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję uzyskuje się w jednoprobówkowej jednorodnej reakcji w ciągu 36 minut.

Minimalizuje to czas pracy, skraca czas przygotowania próbki do wyniku i eliminuje potrzebę stosowania  odczynników do oczyszczania RNA . Mogłoby to umożliwić szersze wykorzystanie testów Covid-19 do diagnozy, badań przesiewowych i badań w krajach i regionach, w których możliwości laboratoryjne są ograniczone.

Specyficzne wychwytywanie i wykrywanie Staphylococcus aureus za pomocą zmodyfikowanych aptamerów o wysokim powinowactwie do składników powierzchni komórki.

Odczynniki zmodyfikowanego aptameru o powolnej dysocjacji (SOMAmer)   wytworzono dla kilku białek związanych z powierzchnią komórki Staphylococcus aureus za pomocą SELEX z wieloma zmodyfikowanymi bibliotekami DNA przy użyciu oczyszczonych białek rekombinowanych lub natywnych. Czynniki wiążące o wysokim powinowactwie z subnanomolarnymi Kd’s otrzymano dla gronkowcowego białka A (SpA), czynników zlepiających (ClfA, ClfB), białek wiążących fibronektynę (FnbA, FnbB) i regulowanych przez żelazo determinant powierzchniowych (Isd). Dalsze badania przesiewowe ujawniły kilka SOMAmerów, które specyficznie wiązały się ze Staph. komórki złocistego ze wszystkich testowanych szczepów, ale nie z innymi gronkowcami lub innymi bakteriami.

SoMAmery SpA i ClfA okazały się przydatne do selektywnego wychwytywania i wzbogacania Staph. komórki aureus, jak wykazała hodowla i  PCR , co prowadzi do poprawy granic wykrywalności i skutecznego usuwania   inhibitorów PCR . Wykrywanie gronkowca. komórki aureus zostały wzmocnione o kilka rzędów wielkości, gdy powierzchnię komórki bakteryjnej pokryto SOMAmerami, a następnie przeprowadzono qPCR  SOMAmerów.

Ponadto znakowane fluorescencyjnie SOMAmery SpA wykazały swoją użyteczność jako  bezpośrednich  środków wykrywających w cytometrii przepływowej. Znaczenie i wpływ badania: Monitorowanie skażenia mikrobiologicznego żywności, wody, produktów niesterylnych lub środowiska zazwyczaj opiera się na kulturze,  reakcji PCR  lub przeciwciałach.

Aptamery, które wiążą się z wysoką swoistością i powinowactwem z dobrze konserwowanymi epitopami na powierzchni komórki, stanowią obiecujący nowy rodzaj  odczynników  do wykrywania komórek bakteryjnych bez potrzeby hodowli lub  lizy komórkowej , w tym do wychwytywania i wzbogacania bakterii obecnych w niskich gęstościach komórek oraz do bezpośrednie   wykrywanie poprzez qPCR lub barwienie  fluorescencyjne.

Optymalizacja  bezpośredniej lampy RT-LAMP w celu wykrywania pasażowalnego SARS-CoV-2 z pierwotnych próbek wymazów z nosogardzieli.

  1. Testy SARS-CoV-2 mają kluczowe znaczenie dla kontrolowania rozprzestrzeniania się tego wirusa, jednak niedobory zasobów do ekstrakcji kwasu nukleinowego i innych kluczowych  odczynników  utrudniły reakcję na COVID-19 w USA.
  2. Kilka grup opisało pętlowe testy izotermicznej amplifikacji (LAMP) dla SARS-CoV-2, w tym testowanie  bezpośrednio z wymazów z nosogardzieli i eliminację potrzeby   braku odczynników .
  3. Częste monitorowanie osób uczęszczających do pracy lub szkoły jest obecnie niedostępne dla większości ludzi, ale prawdopodobnie będzie konieczne, aby zmniejszyć ~50% transmisji, która występuje u osób bezobjawowych.
  4. W tym miejscu opisujemy fluorescencyjny test RT-LAMP przy użyciu  bezpośrednich  próbek wymazów z nosogardzieli i wykazujemy spójne wykrywanie w klinicznie potwierdzonych próbkach pierwotnych z limitem wykrywalności (LOD) wynoszącym ~625 kopii/μl, około 100-krotnie niższą czułością niż qRT- PCR .
  5. Chociaż metoda RT-LAMP bez ekstrakcji RNA jest mniej czuła niż metody molekularne oparte na ekstrakcji, jest szybka i niedroga. Tutaj również pokazujemy, że dodanie   buforu  do lizy bezpośrednio do reakcji RT-LAMP poprawia czułość niektórych próbek około 10-krotnie.
  6. Ponadto oczyszczony RNA w tym teście osiąga podobny LOD do qRT- PCR . Wyniki te wskazują, że wysokowydajne testy RT-LAMP mogą wzmocnić qRT – PCR  w programach nadzoru SARS-CoV-2, zwłaszcza gdy dostępność testów qRT- PCR i odczynników  do ekstrakcji RNA   jest ograniczona.

Walidacja wysokoprzepustowej metodologii analizy pojedynczych komórek.

Wysokowydajne podejścia ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (q PCR ) umożliwiają profilowanie wielu genów w pojedynczych komórkach, dostarczając nowych informacji na temat złożonych procesów biologicznych i oferując możliwości monitorowania komórek rakowych na podstawie pojedynczych komórek i terapii opartych na komórkach macierzystych. Jednak do diagnostyki klinicznej i testowania produktów inżynierii tkankowej wymagane są przepływy pracy z dobrze zdefiniowanymi źródłami zmienności.

W badaniu linii nerwowych komórek macierzystych zbadaliśmy wydajność  etapów lizy , odwrotnej transkrypcji (RT), preamplifikacji (PA) i nanofluidycznego q PCR  na poziomie pojedynczej komórki pod względem wydajności, precyzji i granicy wykrywalności. Porównaliśmy protokoły przy użyciu oddzielnego  buforu do lizy  z wychwytywaniem komórek  bezpośrednio w odczynniku RT-PA  .

Stwierdzono, że obie metody mają podobną   wydajność  lizy , podczas gdy bezpośrednie  podejście RT-PA wykazało lepszą precyzję. Zastosowano cyfrowy  PCR  do powiązania liczby wstępnie amplifikowanych kopii matrycy z wartościami Cq i ujawnienia, gdzie sygnały o niskiej jakości mogą wpływać na analizę .

Zbadaliśmy wpływ strategii kalibracji i normalizacji danych jako środka minimalizacji wpływu zmienności międzyeksperymentalnej na wartości ekspresji genów i stwierdziliśmy, że oba podejścia mogą poprawić porównywalność danych. Niniejsze badanie zapewnia walidację i wskazówki dotyczące zastosowania wysokowydajnych przepływów pracy q PCR  do profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie eksprymowanego genu w izolowanych pojedynczych komórkach w mikrokomorach nową metodą bezpośredniej reakcji gorącej komórki  RT – PCR  .

Aby móc wykryć ekspresję genu w poszczególnych komórkach, ważna jest zdolność do izolacji i lizy pojedynczej komórki oraz przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT- PCR ) w jednym urządzeniu.

Jak zwykle, podczas przeprowadzania  lizy komórek  i RT- PCR  w tej samej komorze reakcyjnej, konieczne jest dodanie  odczynnika  do RT – PCR  po  lizie komórek . W tym badaniu proponujemy oryginalną formułę  lizy komórek  i RT- PCR  w tej samej komorze reakcyjnej bez dodawania  odczynnika  jedynie w procesie ogrzewania, który nazwaliśmy bezpośrednią  RT – PCR z gorącymi komórkami . Bezpośrednia  RT – PCR z użyciem gorących komórek  została umożliwiona dzięki zastosowaniu polimerazy DNA Tth, która jest termostabilną polimerazą i ma wysoką aktywność odwrotnej transkrypcji w obecności jonów manganu. Bezpośrednią  detekcję produktów RT- PCR  przeprowadzono poprzez detekcję fluorescencji za pomocą dwubarwnikowej sondy fluorescencyjnej.

Próbowaliśmy wykryć mRNA genu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) w izolowanych komórkach Jurkat na urządzeniu mikroprzepływowym, które już opracowaliśmy do izolacji pojedynczych komórek.

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)

101-T Cusabio 50 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)

102-T Viagen 100ml 248.4 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

amfiSure Direct PCR Lysis Buffer

D0300-010 GenDepot 100ml 165.6 EUR

mRNAExpress Tail PCR mix (5uM)

MR-TAIL-PR SBI 100 ul 196.8 EUR

TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit

AST-2005 Applied StemCell 100 reactions 156.72 EUR

TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit

AST-2006 Applied StemCell 100 reactions 156.72 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)

401-E Viagen 25 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)

402-E Viagen 50 ml 248.4 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)

301-C Viagen 50 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)

302-C Viagen 100 ml 248.4 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-01 Vazyme 50 rxn (50 μl/rxn) 202.8 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-02 Vazyme 200 rxn (50 μl/rxn) 424.8 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700 GeneOn 100 rcs 159.6 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700-2 GeneOn 5x100 rcs 628.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40013 Bimake 200 ractions 250.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40015 Bimake 500 ractions 490.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45012 Bimake 1ml*5 (500 ractions) 336 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45013 Bimake 1ml*20 (2000 ractions) 1038 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-010 GenDepot 100ml 208.8 EUR

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-050 GenDepot 500ml 380.4 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-01 Vazyme 50 rxn 202.8 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-02 Vazyme 200 rxn 424.8 EUR

FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions

4615 Intact Genomics 1/EA 621.6 EUR

Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase

FYT507-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase

FYT507-50P Yeastern Biotech 50 Preps Ask for price

Mouse Helicobacter PCR kit

PCR-V346-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Mouse Helicobacter PCR kit

PCR-V346-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Mouse Adenovirus PCR kit

PCR-V366-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Mouse Adenovirus PCR kit

PCR-V366-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Mouse cytomegaloviruses PCR kit

PCR-V367-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Mouse cytomegaloviruses PCR kit

PCR-V367-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Mouse Rotavirus PCR kit

PCR-V375-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Mouse Rotavirus PCR kit

PCR-V375-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

PCR Tubes (50)

PCR-50 BioAssay Systems 50 15 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-50P Yeastern Biotech 50 Preps; Ask for price

Mouse hepatitis virus PCR kit

PCR-V371-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Mouse hepatitis virus PCR kit

PCR-V371-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Direct Mouse Genotyping Kit

K1025-200 ApexBio 200 rxns 142.8 EUR

Direct Mouse Genotyping Kit

K1025-500 ApexBio 500 rxns 226.8 EUR

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit

PCR-MPX218-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit

PCR-MPX218-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Mouse parvovirus type 1 PCR kit

PCR-V324-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Mouse parvovirus type 1 PCR kit

PCR-V324-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer120ml Abbexa Lysis Buffer 1 (20 ml) 184.8 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer3100ml Abbexa Lysis Buffer 3 (100ml) 276 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer420ml Abbexa Lysis Buffer 4 (20 ml) 184.8 EUR

MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit

PCR-MPX401-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit

PCR-MPX401-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

ranavirus PCR kit

PCR-V337-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

ranavirus PCR kit

PCR-V337-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-V619-48D Bioingentech 50T 510.96 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-V619-96D Bioingentech 100T 625.8 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-V621-48D Bioingentech 50T 510.96 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-V621-96D Bioingentech 100T 625.8 EUR

Halobacillus PCR kit

PCR-A635-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Halobacillus PCR kit

PCR-A635-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Enterovirus PCR kit

PCR-H433-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Enterovirus PCR kit

PCR-H433-96R Bioingentech 100T 1030.8 EUR

Mengovirus PCR kit

PCR-H453-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Mengovirus PCR kit

PCR-H453-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Astrovirus PCR kit

PCR-H491-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Astrovirus PCR kit

PCR-H491-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Calicivirus PCR kit

PCR-H493-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Calicivirus PCR kit

PCR-H493-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Adenovirus PCR kit

PCR-H501-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Adenovirus PCR kit

PCR-H501-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Polyomavirus PCR kit

PCR-H515-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Polyomavirus PCR kit

PCR-H515-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-H619-48D Bioingentech 48T 543.6 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-H619-96D Bioingentech 96T 686.4 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-H621-48D Bioingentech 48T 543.6 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-H621-96D Bioingentech 96T 686.4 EUR

Sapovirus PCR kit

PCR-H630-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Sapovirus PCR kit

PCR-H630-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Parechovirus PCR kit

PCR-H642-48R Bioingentech 50T 813.6 EUR

Parechovirus PCR kit

PCR-H642-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Metapneumovirus PCR kit

PCR-H643-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Metapneumovirus PCR kit

PCR-H643-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Entamoeba PCR kit

PCR-H683-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Entamoeba PCR kit

PCR-H683-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Acanthamoeba PCR kit

PCR-H684-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Acanthamoeba PCR kit

PCR-H684-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Echovirus PCR kit

PCR-H722-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Echovirus PCR kit

PCR-H722-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-540 GeneOn 20 rcs x 50 µl 196.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-542 GeneOn 100 rcs x 50 µl 658.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-544 GeneOn 1000 rcs x 50 µl 5026.8 EUR

EP Reagent Biuret Reagent

1011601 Scientific Laboratory Supplies 1L 42.18 EUR

EP Reagent Iodoplatinate Reagent

1046300 Scientific Laboratory Supplies 200ML 360.24 EUR

EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent

1053601 Scientific Laboratory Supplies 100ML 354.54 EUR

EP Reagent Molybdovanadic Reagent

1056700 Scientific Laboratory Supplies 100ML 42.18 EUR

 

Po izolacji komórek i kolejnym bezpośrednim  RT – PCR z gorącymi komórkami  na urządzeniu, sygnały fluorescencyjne z produktów RT – PCR  dla pojedynczej komórki zostały wykryte i odróżnione od komory nie zawierającej komórek. Wysoce dodatnią zależność liniową (r = 0,9933) zaobserwowano między liczbą komór zawierających komórki a komórkami zawierającymi produkty RT- PCR  od 10 do 400 komórek μl(-1). W ten sposób możliwe było zastosowanie nowej metody  RT – PCR opartej na gorących komórkach do wykrywania eksprymowanego  genu w izolowanych komórkach.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *