Zapalenie wymienia u bydła jest najważniejszym źródłem strat dla przemysłu mleczarskiego. Szybki i specyficzny test do wykrywania głównych patogenów zapalenia wymienia u bydła nie jest aktualnie dostępny. Opracowano sondy molekularne reagujące w reakcji PCR z bakteryjnym DNA z mleka krowiego, zapewniające bezpośrednie i szybkie wykrywanie Escherichia coli , Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis oraz Streptococcus uberis.
Dla każdego z tych mikroorganizmów zaprojektowano dwa zestawy specyficznych starterów, które wydawały się rozróżniać bliskie filogeniczne gatunki bakterii (np. S. agalactiae i S. dysgalactiae). Ponadto zaprojektowano dwa zestawy uniwersalnych starterów, które reagują jako kontrole pozytywne ze wszystkimi głównymi patogenami zapalenia wymienia u bydła.
Porównano czułość testu z użyciem DNA S. aureus wyekstrahowanego z mleka zi bez etapu lizy enzymatycznej komórek bakteryjnych przed PCR . Granica wykrywalności testu wynosiła 3,125 x 10(2) CFU/ml mleka, gdy DNA S. aureus zostało wyekstrahowane za pomocą etapu enzymatycznego przed PCR , w porównaniu z 5 x 10(3) CFU/ml mleka przy braku etap enzymatyczny przed PCR .
Ten ostatni próg czułości jest nadal zgodny z jego zastosowaniem jako skutecznym narzędziem diagnostycznym w zapaleniu wymienia u bydła, pozwalającym na eliminację drogich odczynników . Te dwa testy PCR pozwalają uniknąć uciążliwych i długich etapów hodowli, można je przeprowadzić w ciągu kilku godzin i są czułe, specyficzne i niezawodne w bezpośrednim wykrywaniu w mleku sześciu najbardziej rozpowszechnionych bakterii powodujących zapalenie wymienia u bydła.
Test szybkiej bezpośredniej amplifikacji kwasów nukleinowych bez ekstrakcji RNA dla SARS-CoV-2 przy użyciu przenośnego termocyklera do PCR .
Trwa ogólnoświatowa pandemia choroby koronawirusowej 2019 (Covid-19) spowodowana przez koronawirus 2 zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2). Obecnie diagnoza potwierdzająca opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT – PCR ), zwykle trwającą kilka godzin i wymagającą laboratorium molekularnego.
Istnieje pilna potrzeba szybkich, uproszczonych i opłacalnych metod wykrywania. Opracowaliśmy i poddaliśmy walidacji analitycznej protokół do bezpośredniego wykrywania SARS-CoV-2 metodą szybkiej, wolnej od ekstrakcji metodą PCR ( DIRECT – PCR ) bez konieczności oczyszczania kwasu nukleinowego.
Tylko sześć kopii RNA na reakcję genu nukleokapsydu wirusa (N) z próbek oddechowych, takich jak plwocina i wysięk z nosa, można wykryć bezpośrednio za pomocą naszego jednoetapowego testu odporności na inhibitor.
Wydajność tego testu została zwalidowana na dostępnym w handlu przenośnym termocyklerze PCR . Lizę wirusa , odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję uzyskuje się w jednoprobówkowej jednorodnej reakcji w ciągu 36 minut.
Minimalizuje to czas pracy, skraca czas przygotowania próbki do wyniku i eliminuje potrzebę stosowania odczynników do oczyszczania RNA . Mogłoby to umożliwić szersze wykorzystanie testów Covid-19 do diagnozy, badań przesiewowych i badań w krajach i regionach, w których możliwości laboratoryjne są ograniczone.
Specyficzne wychwytywanie i wykrywanie Staphylococcus aureus za pomocą zmodyfikowanych aptamerów o wysokim powinowactwie do składników powierzchni komórki.
Odczynniki zmodyfikowanego aptameru o powolnej dysocjacji (SOMAmer) wytworzono dla kilku białek związanych z powierzchnią komórki Staphylococcus aureus za pomocą SELEX z wieloma zmodyfikowanymi bibliotekami DNA przy użyciu oczyszczonych białek rekombinowanych lub natywnych. Czynniki wiążące o wysokim powinowactwie z subnanomolarnymi Kd’s otrzymano dla gronkowcowego białka A (SpA), czynników zlepiających (ClfA, ClfB), białek wiążących fibronektynę (FnbA, FnbB) i regulowanych przez żelazo determinant powierzchniowych (Isd). Dalsze badania przesiewowe ujawniły kilka SOMAmerów, które specyficznie wiązały się ze Staph. komórki złocistego ze wszystkich testowanych szczepów, ale nie z innymi gronkowcami lub innymi bakteriami.
SoMAmery SpA i ClfA okazały się przydatne do selektywnego wychwytywania i wzbogacania Staph. komórki aureus, jak wykazała hodowla i PCR , co prowadzi do poprawy granic wykrywalności i skutecznego usuwania inhibitorów PCR . Wykrywanie gronkowca. komórki aureus zostały wzmocnione o kilka rzędów wielkości, gdy powierzchnię komórki bakteryjnej pokryto SOMAmerami, a następnie przeprowadzono qPCR SOMAmerów.
Ponadto znakowane fluorescencyjnie SOMAmery SpA wykazały swoją użyteczność jako bezpośrednich środków wykrywających w cytometrii przepływowej. Znaczenie i wpływ badania: Monitorowanie skażenia mikrobiologicznego żywności, wody, produktów niesterylnych lub środowiska zazwyczaj opiera się na kulturze, reakcji PCR lub przeciwciałach.
Aptamery, które wiążą się z wysoką swoistością i powinowactwem z dobrze konserwowanymi epitopami na powierzchni komórki, stanowią obiecujący nowy rodzaj odczynników do wykrywania komórek bakteryjnych bez potrzeby hodowli lub lizy komórkowej , w tym do wychwytywania i wzbogacania bakterii obecnych w niskich gęstościach komórek oraz do bezpośrednie wykrywanie poprzez qPCR lub barwienie fluorescencyjne.
Optymalizacja bezpośredniej lampy RT-LAMP w celu wykrywania pasażowalnego SARS-CoV-2 z pierwotnych próbek wymazów z nosogardzieli.
- Testy SARS-CoV-2 mają kluczowe znaczenie dla kontrolowania rozprzestrzeniania się tego wirusa, jednak niedobory zasobów do ekstrakcji kwasu nukleinowego i innych kluczowych odczynników utrudniły reakcję na COVID-19 w USA.
- Kilka grup opisało pętlowe testy izotermicznej amplifikacji (LAMP) dla SARS-CoV-2, w tym testowanie bezpośrednio z wymazów z nosogardzieli i eliminację potrzeby braku odczynników .
- Częste monitorowanie osób uczęszczających do pracy lub szkoły jest obecnie niedostępne dla większości ludzi, ale prawdopodobnie będzie konieczne, aby zmniejszyć ~50% transmisji, która występuje u osób bezobjawowych.
- W tym miejscu opisujemy fluorescencyjny test RT-LAMP przy użyciu bezpośrednich próbek wymazów z nosogardzieli i wykazujemy spójne wykrywanie w klinicznie potwierdzonych próbkach pierwotnych z limitem wykrywalności (LOD) wynoszącym ~625 kopii/μl, około 100-krotnie niższą czułością niż qRT- PCR .
- Chociaż metoda RT-LAMP bez ekstrakcji RNA jest mniej czuła niż metody molekularne oparte na ekstrakcji, jest szybka i niedroga. Tutaj również pokazujemy, że dodanie buforu do lizy bezpośrednio do reakcji RT-LAMP poprawia czułość niektórych próbek około 10-krotnie.
- Ponadto oczyszczony RNA w tym teście osiąga podobny LOD do qRT- PCR . Wyniki te wskazują, że wysokowydajne testy RT-LAMP mogą wzmocnić qRT – PCR w programach nadzoru SARS-CoV-2, zwłaszcza gdy dostępność testów qRT- PCR i odczynników do ekstrakcji RNA jest ograniczona.
Walidacja wysokoprzepustowej metodologii analizy pojedynczych komórek.
Wysokowydajne podejścia ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (q PCR ) umożliwiają profilowanie wielu genów w pojedynczych komórkach, dostarczając nowych informacji na temat złożonych procesów biologicznych i oferując możliwości monitorowania komórek rakowych na podstawie pojedynczych komórek i terapii opartych na komórkach macierzystych. Jednak do diagnostyki klinicznej i testowania produktów inżynierii tkankowej wymagane są przepływy pracy z dobrze zdefiniowanymi źródłami zmienności.
W badaniu linii nerwowych komórek macierzystych zbadaliśmy wydajność etapów lizy , odwrotnej transkrypcji (RT), preamplifikacji (PA) i nanofluidycznego q PCR na poziomie pojedynczej komórki pod względem wydajności, precyzji i granicy wykrywalności. Porównaliśmy protokoły przy użyciu oddzielnego buforu do lizy z wychwytywaniem komórek bezpośrednio w odczynniku RT-PA .
Stwierdzono, że obie metody mają podobną wydajność lizy , podczas gdy bezpośrednie podejście RT-PA wykazało lepszą precyzję. Zastosowano cyfrowy PCR do powiązania liczby wstępnie amplifikowanych kopii matrycy z wartościami Cq i ujawnienia, gdzie sygnały o niskiej jakości mogą wpływać na analizę .
Zbadaliśmy wpływ strategii kalibracji i normalizacji danych jako środka minimalizacji wpływu zmienności międzyeksperymentalnej na wartości ekspresji genów i stwierdziliśmy, że oba podejścia mogą poprawić porównywalność danych. Niniejsze badanie zapewnia walidację i wskazówki dotyczące zastosowania wysokowydajnych przepływów pracy q PCR do profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach.
Wykrywanie eksprymowanego genu w izolowanych pojedynczych komórkach w mikrokomorach nową metodą bezpośredniej reakcji gorącej komórki RT – PCR .
Aby móc wykryć ekspresję genu w poszczególnych komórkach, ważna jest zdolność do izolacji i lizy pojedynczej komórki oraz przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT- PCR ) w jednym urządzeniu.
Jak zwykle, podczas przeprowadzania lizy komórek i RT- PCR w tej samej komorze reakcyjnej, konieczne jest dodanie odczynnika do RT – PCR po lizie komórek . W tym badaniu proponujemy oryginalną formułę lizy komórek i RT- PCR w tej samej komorze reakcyjnej bez dodawania odczynnika jedynie w procesie ogrzewania, który nazwaliśmy bezpośrednią RT – PCR z gorącymi komórkami . Bezpośrednia RT – PCR z użyciem gorących komórek została umożliwiona dzięki zastosowaniu polimerazy DNA Tth, która jest termostabilną polimerazą i ma wysoką aktywność odwrotnej transkrypcji w obecności jonów manganu. Bezpośrednią detekcję produktów RT- PCR przeprowadzono poprzez detekcję fluorescencji za pomocą dwubarwnikowej sondy fluorescencyjnej.
Próbowaliśmy wykryć mRNA genu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) w izolowanych komórkach Jurkat na urządzeniu mikroprzepływowym, które już opracowaliśmy do izolacji pojedynczych komórek.
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL) |
|||
101-T | Cusabio | 50 ml | 169.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL) |
|||
102-T | Viagen | 100ml | 248.4 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR) |
|||
401-E | Viagen | 25 ml | 169.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR) |
|||
402-E | Viagen | 50 ml | 248.4 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL) |
|||
301-C | Viagen | 50 ml | 169.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL) |
|||
302-C | Viagen | 100 ml | 248.4 EUR |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-MT01100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-MT01500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
amfiSure Direct PCR Lysis Buffer |
|||
D0300-010 | GenDepot | 100ml | 165.6 EUR |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-MT02100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-MT02500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit |
|||
AST-2005 | Applied StemCell | 100 reactions | 156.72 EUR |
TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit |
|||
AST-2006 | Applied StemCell | 100 reactions | 156.72 EUR |
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free |
|||
X3100-010 | GenDepot | 100ml | 208.8 EUR |
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free |
|||
X3100-050 | GenDepot | 500ml | 380.4 EUR |
Alkphos Direct Labelling Reagents |
|||
RPN3680 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 813.6 EUR |
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-BD01100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-BD01500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B40013 | Bimake | 200 ractions | 250.8 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B40015 | Bimake | 500 ractions | 490.8 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B45012 | Bimake | 1ml*5 (500 ractions) | 336 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B45013 | Bimake | 1ml*20 (2000 ractions) | 1038 EUR |
DIRECTPCR LYSIS RGNT(YOLK SAC) |
|||
201-Y | Viagen | 50 ml | 169.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS YOLK SAC 100ML |
|||
202-Y | Viagen | 100 ml | 248.4 EUR |
Plant Direct PCR Kit |
|||
PD105-01 | Vazyme | 50 rxn (50 μl/rxn) | 202.8 EUR |
Plant Direct PCR Kit |
|||
PD105-02 | Vazyme | 200 rxn (50 μl/rxn) | 424.8 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
|||
S700 | GeneOn | 100 rcs | 159.6 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
|||
S700-2 | GeneOn | 5x100 rcs | 628.8 EUR |
FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions |
|||
4615 | Intact Genomics | 1/EA | 621.6 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
|||
PD103-01 | Vazyme | 50 rxn | 202.8 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
|||
PD103-02 | Vazyme | 200 rxn | 424.8 EUR |
cAMP Biotrak(TM) EIA; (Non-Acetylation Protocol; Lysis Reagents not Included); Cytiva; RPN2251 |
|||
GERPN2251 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 685.2 EUR |
Mouse IgG Blocking Reagent |
|||
30R-AH071 | Fitzgerald | 20 mg | 309.6 EUR |
EP Reagent Biuret Reagent |
|||
1011601 | Scientific Laboratory Supplies | 1L | 52.8 EUR |
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-BD02100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-BD02500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
EP Reagent Iodoplatinate Reagent |
|||
1046300 | Scientific Laboratory Supplies | 200ML | 446.4 EUR |
EP Reagent Molybdovanadic Reagent |
|||
1056700 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 52.8 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
|||
105-540 | GeneOn | 20 rcs x 50 µl | 196.8 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
|||
105-542 | GeneOn | 100 rcs x 50 µl | 658.8 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
|||
105-544 | GeneOn | 1000 rcs x 50 µl | 5026.8 EUR |
Mouse-to-Mouse Blocking Reagent |
|||
MTM008 | ScyTek Laboratories | 8 ml | 96 EUR |
Mouse-to-Mouse Blocking Reagent |
|||
MTM015 | ScyTek Laboratories | 15 ml | 105.6 EUR |
Mouse-to-Mouse Blocking Reagent |
|||
MTM125 | ScyTek Laboratories | 125 ml | 434.4 EUR |
Mouse-to-Mouse Blocking Reagent |
|||
MTM500 | ScyTek Laboratories | 500 ml | 991.2 EUR |
EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent |
|||
1053601 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 435.6 EUR |
EP Reagent Sulfomolybdic Reagent R3 |
|||
1086500 | Scientific Laboratory Supplies | 1L | 354 EUR |
EP Reagent Phosphomolybdotungstic Reagent |
|||
1065000 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 201.6 EUR |
Direct Mouse Genotyping Kit |
|||
K1025-200 | ApexBio | 200 rxns | 142.8 EUR |
Direct Mouse Genotyping Kit |
|||
K1025-500 | ApexBio | 500 rxns | 226.8 EUR |
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase |
|||
FYT506-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase |
|||
FYT506-50P | Yeastern Biotech | 50 Preps; | Ask for price |
Direct PCRKits for Blood |
|||
FYT302-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Direct PCRKits for Plant |
|||
FYT303-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
MTS Reagent |
|||
2808-1000 | Biovision | each | 1188 EUR |
MTS Reagent |
|||
2808-250 | Biovision | each | 438 EUR |
MTT Reagent |
|||
2809-1G | Biovision | each | 216 EUR |
MTT Reagent |
|||
2809-5G | Biovision | each | 652.8 EUR |
BOP reagent |
|||
5-02141 | CHI Scientific | 25g | Ask for price |
BOP reagent |
|||
5-02142 | CHI Scientific | 100g | Ask for price |
BOP reagent |
|||
A7015-100000 | ApexBio | 100 g | 240 EUR |
BOP reagent |
|||
A7015-25000 | ApexBio | 25 g | 135.6 EUR |
Traut's Reagent |
|||
2330-1000 | Biovision | each | 418.8 EUR |
Traut's Reagent |
|||
2330-500 | Biovision | each | 248.4 EUR |
VeZol Reagent |
|||
R411-01 | Vazyme | 100 ml | 76.4 EUR |
VeZol Reagent |
|||
R411-02 | Vazyme | 200 ml | 127.6 EUR |
Bluing Reagent |
|||
BRT030 | ScyTek Laboratories | 30 ml | 72 EUR |
Bluing Reagent |
|||
BRT125 | ScyTek Laboratories | 125 ml | 75.6 EUR |
Bluing Reagent |
|||
BRT3800 | ScyTek Laboratories | 1 Gal. | 220.8 EUR |
Bluing Reagent |
|||
BRT500 | ScyTek Laboratories | 500 ml | 91.2 EUR |
Bluing Reagent |
|||
BRT999 | ScyTek Laboratories | 1000 ml | 105.6 EUR |
Chymase reagent |
|||
30C-CP1129 | Fitzgerald | 5 units | 2622 EUR |
BURGESS REAGENT |
|||
702010 | Survival Technologies | each | Ask for price |
Nessler Reagent |
|||
NESSR | Scientific Laboratory Supplies | 500ML | 182.4 EUR |
FreeZol Reagent |
|||
R711-01 | Vazyme | 100 ml | 71.2 EUR |
FreeZol Reagent |
|||
R711-02 | Vazyme | 200 ml | 127.2 EUR |
Chromium Reagent |
|||
1206699 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 157.2 EUR |
Bradford reagent |
|||
BDE641 | Bio Basic | 100ml | 73.21 EUR |
Beaucage reagent |
|||
HY-100951 | MedChemExpress | 10mM/1mL | 151.2 EUR |
Bradford Reagent |
|||
GT1202-1 | Glentham Life Sciences | 1 | 165.7 EUR |
Bradford Reagent |
|||
GT1202-500 | Glentham Life Sciences | 500 | 105.5 EUR |
Barfoeds Reagent |
|||
RRSP6363-D | Atom Scientific | 500ml | 10.8 EUR |
Cod Reagent 0-15000Ppm |
|||
24159-51 | Scientific Laboratory Supplies | PK25 | 116.4 EUR |
Phosphate Reagent |
|||
106199 | Scientific Laboratory Supplies | PK100 | 69.6 EUR |
Ninhydrin Reagent |
|||
MIC6746 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 31.12 EUR |
COD Reagent (1977 method) |
|||
WTR50W | Scientific Laboratory Supplies | 2.5L | 135.6 EUR |
ECL Start Reagent 2000cm2 |
|||
RPN3243 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 138 EUR |
ECL Start Reagent 4000cm2 |
|||
RPN3244 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 222 EUR |
BCA Reagent, 16ML |
|||
C144-16ML | Arbor Assays | 16ML | 132 EUR |
TDA Reagent - 10mL |
|||
MIC6732 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 26.33 EUR |
PYR Reagent - 10mL |
|||
MIC6744 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 31.12 EUR |
Thioacetamide Reagent |
|||
THIOR01 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 99.6 EUR |
Girard's reagent T |
|||
20-abx184099 | Abbexa |
|
|
Silica 3 Reagent |
|||
27169 | Scientific Laboratory Supplies | 100ML | 99.6 EUR |
BSA (Reagent Grade) |
|||
30-AB79 | Fitzgerald | 1 kg | 1862.4 EUR |
BSA (Reagent Grade) |
|||
30-AB81 | Fitzgerald | 200 grams | 571.2 EUR |
Tri-RNA Reagent |
|||
FATRR-001 | Favorgen | 100ml | 283.2 EUR |
Tri-RNA Reagent |
|||
FATRR-002 | Favorgen | 50ml | 211.2 EUR |
Tri-RNA Reagent |
|||
FATRR-003 | Favorgen | 450ml | 774 EUR |
Schiff''s reagent |
|||
GT3929-1 | Glentham Life Sciences | 1 | 113.1 EUR |
Po izolacji komórek i kolejnym bezpośrednim RT – PCR z gorącymi komórkami na urządzeniu, sygnały fluorescencyjne z produktów RT – PCR dla pojedynczej komórki zostały wykryte i odróżnione od komory nie zawierającej komórek. Wysoce dodatnią zależność liniową (r = 0,9933) zaobserwowano między liczbą komór zawierających komórki a komórkami zawierającymi produkty RT- PCR od 10 do 400 komórek μl(-1). W ten sposób możliwe było zastosowanie nowej metody RT – PCR opartej na gorących komórkach do wykrywania eksprymowanego genu w izolowanych komórkach.