Opracowanie szybkiego i czułego testu do identyfikacji głównych patogenów w zapaleniu wymienia u bydła metodą PCR.

Zapalenie wymienia u bydła jest najważniejszym źródłem strat dla przemysłu mleczarskiego. Szybki i specyficzny test do wykrywania głównych patogenów zapalenia wymienia u bydła nie jest aktualnie dostępny. Opracowano sondy molekularne reagujące w reakcji  PCR  z bakteryjnym DNA z mleka krowiego, zapewniające  bezpośrednie  i szybkie wykrywanie Escherichia coli , Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis oraz Streptococcus uberis.

Dla każdego z tych mikroorganizmów zaprojektowano dwa zestawy specyficznych starterów, które wydawały się rozróżniać bliskie filogeniczne gatunki bakterii (np. S. agalactiae i S. dysgalactiae). Ponadto zaprojektowano dwa zestawy uniwersalnych starterów, które reagują jako kontrole pozytywne ze wszystkimi głównymi patogenami zapalenia wymienia u bydła.

Porównano czułość testu z użyciem DNA S. aureus wyekstrahowanego z mleka zi bez etapu lizy  enzymatycznej  komórek  bakteryjnych przed PCR . Granica wykrywalności testu wynosiła 3,125 x 10(2) CFU/ml mleka, gdy DNA S. aureus zostało wyekstrahowane za pomocą etapu enzymatycznego przed PCR  , w porównaniu z 5 x 10(3) CFU/ml mleka przy braku  etap enzymatyczny przed PCR .

Ten ostatni próg czułości jest nadal zgodny z jego zastosowaniem jako skutecznym narzędziem diagnostycznym w zapaleniu wymienia u bydła, pozwalającym na eliminację drogich  odczynników . Te dwa  testy PCR  pozwalają uniknąć uciążliwych i długich etapów hodowli, można je przeprowadzić w ciągu kilku godzin i są czułe, specyficzne i niezawodne w  bezpośrednim  wykrywaniu w mleku sześciu najbardziej rozpowszechnionych bakterii powodujących zapalenie wymienia u bydła.

Test szybkiej  bezpośredniej  amplifikacji kwasów nukleinowych bez ekstrakcji RNA dla SARS-CoV-2 przy użyciu przenośnego  termocyklera do PCR .

Trwa ogólnoświatowa pandemia choroby koronawirusowej 2019 (Covid-19) spowodowana przez koronawirus 2 zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2). Obecnie diagnoza potwierdzająca opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT – PCR ), zwykle trwającą kilka godzin i wymagającą laboratorium molekularnego.

Istnieje pilna potrzeba szybkich, uproszczonych i opłacalnych metod wykrywania. Opracowaliśmy i poddaliśmy walidacji analitycznej protokół do  bezpośredniego wykrywania SARS-CoV-2 metodą  szybkiej, wolnej od ekstrakcji  metodą PCR  ( DIRECT – PCR ) bez konieczności oczyszczania kwasu nukleinowego.

Tylko sześć kopii RNA na reakcję genu nukleokapsydu wirusa (N) z próbek oddechowych, takich jak plwocina i wysięk z nosa, można wykryć  bezpośrednio za pomocą naszego jednoetapowego testu odporności na inhibitor.

Wydajność tego testu została zwalidowana na dostępnym w handlu przenośnym   termocyklerze PCR . Lizę wirusa  , odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję uzyskuje się w jednoprobówkowej jednorodnej reakcji w ciągu 36 minut.

Minimalizuje to czas pracy, skraca czas przygotowania próbki do wyniku i eliminuje potrzebę stosowania  odczynników do oczyszczania RNA . Mogłoby to umożliwić szersze wykorzystanie testów Covid-19 do diagnozy, badań przesiewowych i badań w krajach i regionach, w których możliwości laboratoryjne są ograniczone.

Specyficzne wychwytywanie i wykrywanie Staphylococcus aureus za pomocą zmodyfikowanych aptamerów o wysokim powinowactwie do składników powierzchni komórki.

Odczynniki zmodyfikowanego aptameru o powolnej dysocjacji (SOMAmer)   wytworzono dla kilku białek związanych z powierzchnią komórki Staphylococcus aureus za pomocą SELEX z wieloma zmodyfikowanymi bibliotekami DNA przy użyciu oczyszczonych białek rekombinowanych lub natywnych. Czynniki wiążące o wysokim powinowactwie z subnanomolarnymi Kd’s otrzymano dla gronkowcowego białka A (SpA), czynników zlepiających (ClfA, ClfB), białek wiążących fibronektynę (FnbA, FnbB) i regulowanych przez żelazo determinant powierzchniowych (Isd). Dalsze badania przesiewowe ujawniły kilka SOMAmerów, które specyficznie wiązały się ze Staph. komórki złocistego ze wszystkich testowanych szczepów, ale nie z innymi gronkowcami lub innymi bakteriami.

SoMAmery SpA i ClfA okazały się przydatne do selektywnego wychwytywania i wzbogacania Staph. komórki aureus, jak wykazała hodowla i  PCR , co prowadzi do poprawy granic wykrywalności i skutecznego usuwania   inhibitorów PCR . Wykrywanie gronkowca. komórki aureus zostały wzmocnione o kilka rzędów wielkości, gdy powierzchnię komórki bakteryjnej pokryto SOMAmerami, a następnie przeprowadzono qPCR  SOMAmerów.

Ponadto znakowane fluorescencyjnie SOMAmery SpA wykazały swoją użyteczność jako  bezpośrednich  środków wykrywających w cytometrii przepływowej. Znaczenie i wpływ badania: Monitorowanie skażenia mikrobiologicznego żywności, wody, produktów niesterylnych lub środowiska zazwyczaj opiera się na kulturze,  reakcji PCR  lub przeciwciałach.

Aptamery, które wiążą się z wysoką swoistością i powinowactwem z dobrze konserwowanymi epitopami na powierzchni komórki, stanowią obiecujący nowy rodzaj  odczynników  do wykrywania komórek bakteryjnych bez potrzeby hodowli lub  lizy komórkowej , w tym do wychwytywania i wzbogacania bakterii obecnych w niskich gęstościach komórek oraz do bezpośrednie   wykrywanie poprzez qPCR lub barwienie  fluorescencyjne.

Optymalizacja  bezpośredniej lampy RT-LAMP w celu wykrywania pasażowalnego SARS-CoV-2 z pierwotnych próbek wymazów z nosogardzieli.

  1. Testy SARS-CoV-2 mają kluczowe znaczenie dla kontrolowania rozprzestrzeniania się tego wirusa, jednak niedobory zasobów do ekstrakcji kwasu nukleinowego i innych kluczowych  odczynników  utrudniły reakcję na COVID-19 w USA.
  2. Kilka grup opisało pętlowe testy izotermicznej amplifikacji (LAMP) dla SARS-CoV-2, w tym testowanie  bezpośrednio z wymazów z nosogardzieli i eliminację potrzeby   braku odczynników .
  3. Częste monitorowanie osób uczęszczających do pracy lub szkoły jest obecnie niedostępne dla większości ludzi, ale prawdopodobnie będzie konieczne, aby zmniejszyć ~50% transmisji, która występuje u osób bezobjawowych.
  4. W tym miejscu opisujemy fluorescencyjny test RT-LAMP przy użyciu  bezpośrednich  próbek wymazów z nosogardzieli i wykazujemy spójne wykrywanie w klinicznie potwierdzonych próbkach pierwotnych z limitem wykrywalności (LOD) wynoszącym ~625 kopii/μl, około 100-krotnie niższą czułością niż qRT- PCR .
  5. Chociaż metoda RT-LAMP bez ekstrakcji RNA jest mniej czuła niż metody molekularne oparte na ekstrakcji, jest szybka i niedroga. Tutaj również pokazujemy, że dodanie   buforu  do lizy bezpośrednio do reakcji RT-LAMP poprawia czułość niektórych próbek około 10-krotnie.
  6. Ponadto oczyszczony RNA w tym teście osiąga podobny LOD do qRT- PCR . Wyniki te wskazują, że wysokowydajne testy RT-LAMP mogą wzmocnić qRT – PCR  w programach nadzoru SARS-CoV-2, zwłaszcza gdy dostępność testów qRT- PCR i odczynników  do ekstrakcji RNA   jest ograniczona.

Walidacja wysokoprzepustowej metodologii analizy pojedynczych komórek.

Wysokowydajne podejścia ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (q PCR ) umożliwiają profilowanie wielu genów w pojedynczych komórkach, dostarczając nowych informacji na temat złożonych procesów biologicznych i oferując możliwości monitorowania komórek rakowych na podstawie pojedynczych komórek i terapii opartych na komórkach macierzystych. Jednak do diagnostyki klinicznej i testowania produktów inżynierii tkankowej wymagane są przepływy pracy z dobrze zdefiniowanymi źródłami zmienności.

W badaniu linii nerwowych komórek macierzystych zbadaliśmy wydajność  etapów lizy , odwrotnej transkrypcji (RT), preamplifikacji (PA) i nanofluidycznego q PCR  na poziomie pojedynczej komórki pod względem wydajności, precyzji i granicy wykrywalności. Porównaliśmy protokoły przy użyciu oddzielnego  buforu do lizy  z wychwytywaniem komórek  bezpośrednio w odczynniku RT-PA  .

Stwierdzono, że obie metody mają podobną   wydajność  lizy , podczas gdy bezpośrednie  podejście RT-PA wykazało lepszą precyzję. Zastosowano cyfrowy  PCR  do powiązania liczby wstępnie amplifikowanych kopii matrycy z wartościami Cq i ujawnienia, gdzie sygnały o niskiej jakości mogą wpływać na analizę .

Zbadaliśmy wpływ strategii kalibracji i normalizacji danych jako środka minimalizacji wpływu zmienności międzyeksperymentalnej na wartości ekspresji genów i stwierdziliśmy, że oba podejścia mogą poprawić porównywalność danych. Niniejsze badanie zapewnia walidację i wskazówki dotyczące zastosowania wysokowydajnych przepływów pracy q PCR  do profilowania ekspresji genów w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie eksprymowanego genu w izolowanych pojedynczych komórkach w mikrokomorach nową metodą bezpośredniej reakcji gorącej komórki  RT – PCR  .

Aby móc wykryć ekspresję genu w poszczególnych komórkach, ważna jest zdolność do izolacji i lizy pojedynczej komórki oraz przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT- PCR ) w jednym urządzeniu.

Jak zwykle, podczas przeprowadzania  lizy komórek  i RT- PCR  w tej samej komorze reakcyjnej, konieczne jest dodanie  odczynnika  do RT – PCR  po  lizie komórek . W tym badaniu proponujemy oryginalną formułę  lizy komórek  i RT- PCR  w tej samej komorze reakcyjnej bez dodawania  odczynnika  jedynie w procesie ogrzewania, który nazwaliśmy bezpośrednią  RT – PCR z gorącymi komórkami . Bezpośrednia  RT – PCR z użyciem gorących komórek  została umożliwiona dzięki zastosowaniu polimerazy DNA Tth, która jest termostabilną polimerazą i ma wysoką aktywność odwrotnej transkrypcji w obecności jonów manganu. Bezpośrednią  detekcję produktów RT- PCR  przeprowadzono poprzez detekcję fluorescencji za pomocą dwubarwnikowej sondy fluorescencyjnej.

Próbowaliśmy wykryć mRNA genu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) w izolowanych komórkach Jurkat na urządzeniu mikroprzepływowym, które już opracowaliśmy do izolacji pojedynczych komórek.

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)

101-T Cusabio 50 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)

102-T Viagen 100ml 248.4 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)

401-E Viagen 25 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)

402-E Viagen 50 ml 248.4 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)

301-C Viagen 50 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)

302-C Viagen 100 ml 248.4 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

amfiSure Direct PCR Lysis Buffer

D0300-010 GenDepot 100ml 165.6 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit

AST-2005 Applied StemCell 100 reactions 156.72 EUR

TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit

AST-2006 Applied StemCell 100 reactions 156.72 EUR

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-010 GenDepot 100ml 208.8 EUR

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-050 GenDepot 500ml 380.4 EUR

Alkphos Direct Labelling Reagents

RPN3680 Scientific Laboratory Supplies EACH 813.6 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40013 Bimake 200 ractions 250.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40015 Bimake 500 ractions 490.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45012 Bimake 1ml*5 (500 ractions) 336 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45013 Bimake 1ml*20 (2000 ractions) 1038 EUR

DIRECTPCR LYSIS RGNT(YOLK SAC)

201-Y Viagen 50 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS YOLK SAC 100ML

202-Y Viagen 100 ml 248.4 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-01 Vazyme 50 rxn (50 μl/rxn) 202.8 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-02 Vazyme 200 rxn (50 μl/rxn) 424.8 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700 GeneOn 100 rcs 159.6 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700-2 GeneOn 5x100 rcs 628.8 EUR

FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions

4615 Intact Genomics 1/EA 621.6 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-01 Vazyme 50 rxn 202.8 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-02 Vazyme 200 rxn 424.8 EUR

cAMP Biotrak(TM) EIA; (Non-Acetylation Protocol; Lysis Reagents not Included); Cytiva; RPN2251

GERPN2251 Scientific Laboratory Supplies EACH 685.2 EUR

Mouse IgG Blocking Reagent

30R-AH071 Fitzgerald 20 mg 309.6 EUR

EP Reagent Biuret Reagent

1011601 Scientific Laboratory Supplies 1L 52.8 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

EP Reagent Iodoplatinate Reagent

1046300 Scientific Laboratory Supplies 200ML 446.4 EUR

EP Reagent Molybdovanadic Reagent

1056700 Scientific Laboratory Supplies 100ML 52.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-540 GeneOn 20 rcs x 50 µl 196.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-542 GeneOn 100 rcs x 50 µl 658.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-544 GeneOn 1000 rcs x 50 µl 5026.8 EUR

Mouse-to-Mouse Blocking Reagent

MTM008 ScyTek Laboratories 8 ml 96 EUR

Mouse-to-Mouse Blocking Reagent

MTM015 ScyTek Laboratories 15 ml 105.6 EUR

Mouse-to-Mouse Blocking Reagent

MTM125 ScyTek Laboratories 125 ml 434.4 EUR

Mouse-to-Mouse Blocking Reagent

MTM500 ScyTek Laboratories 500 ml 991.2 EUR

EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent

1053601 Scientific Laboratory Supplies 100ML 435.6 EUR

EP Reagent Sulfomolybdic Reagent R3

1086500 Scientific Laboratory Supplies 1L 354 EUR

EP Reagent Phosphomolybdotungstic Reagent

1065000 Scientific Laboratory Supplies 100ML 201.6 EUR

Direct Mouse Genotyping Kit

K1025-200 ApexBio 200 rxns 142.8 EUR

Direct Mouse Genotyping Kit

K1025-500 ApexBio 500 rxns 226.8 EUR

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-50P Yeastern Biotech 50 Preps; Ask for price

Direct PCRKits for Blood

FYT302-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct PCRKits for Plant

FYT303-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

MTS Reagent

2808-1000 Biovision each 1188 EUR

MTS Reagent

2808-250 Biovision each 438 EUR

MTT Reagent

2809-1G Biovision each 216 EUR

MTT Reagent

2809-5G Biovision each 652.8 EUR

BOP reagent

5-02141 CHI Scientific 25g Ask for price

BOP reagent

5-02142 CHI Scientific 100g Ask for price

BOP reagent

A7015-100000 ApexBio 100 g 240 EUR

BOP reagent

A7015-25000 ApexBio 25 g 135.6 EUR

Traut's Reagent

2330-1000 Biovision each 418.8 EUR

Traut's Reagent

2330-500 Biovision each 248.4 EUR

VeZol Reagent

R411-01 Vazyme 100 ml 76.4 EUR

VeZol Reagent

R411-02 Vazyme 200 ml 127.6 EUR

Bluing Reagent

BRT030 ScyTek Laboratories 30 ml 72 EUR

Bluing Reagent

BRT125 ScyTek Laboratories 125 ml 75.6 EUR

Bluing Reagent

BRT3800 ScyTek Laboratories 1 Gal. 220.8 EUR

Bluing Reagent

BRT500 ScyTek Laboratories 500 ml 91.2 EUR

Bluing Reagent

BRT999 ScyTek Laboratories 1000 ml 105.6 EUR

Chymase reagent

30C-CP1129 Fitzgerald 5 units 2622 EUR

BURGESS REAGENT

702010 Survival Technologies each Ask for price

Nessler Reagent

NESSR Scientific Laboratory Supplies 500ML 182.4 EUR

FreeZol Reagent

R711-01 Vazyme 100 ml 71.2 EUR

FreeZol Reagent

R711-02 Vazyme 200 ml 127.2 EUR

Chromium Reagent

1206699 Scientific Laboratory Supplies EACH 157.2 EUR

Bradford reagent

BDE641 Bio Basic 100ml 73.21 EUR

Beaucage reagent

HY-100951 MedChemExpress 10mM/1mL 151.2 EUR

Bradford Reagent

GT1202-1 Glentham Life Sciences 1 165.7 EUR

Bradford Reagent

GT1202-500 Glentham Life Sciences 500 105.5 EUR

Barfoeds Reagent

RRSP6363-D Atom Scientific 500ml 10.8 EUR

Cod Reagent 0-15000Ppm

24159-51 Scientific Laboratory Supplies PK25 116.4 EUR

Phosphate Reagent

106199 Scientific Laboratory Supplies PK100 69.6 EUR

Ninhydrin Reagent

MIC6746 Scientific Laboratory Supplies EACH 31.12 EUR

COD Reagent (1977 method)

WTR50W Scientific Laboratory Supplies 2.5L 135.6 EUR

ECL Start Reagent 2000cm2

RPN3243 Scientific Laboratory Supplies EACH 138 EUR

ECL Start Reagent 4000cm2

RPN3244 Scientific Laboratory Supplies EACH 222 EUR

BCA Reagent, 16ML

C144-16ML Arbor Assays 16ML 132 EUR

TDA Reagent - 10mL

MIC6732 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

PYR Reagent - 10mL

MIC6744 Scientific Laboratory Supplies EACH 31.12 EUR

Thioacetamide Reagent

THIOR01 Scientific Laboratory Supplies 100ML 99.6 EUR

Girard's reagent T

20-abx184099 Abbexa
  • 243.60 EUR
  • 376.80 EUR
  • 100 g
  • 500 g

Silica 3 Reagent

27169 Scientific Laboratory Supplies 100ML 99.6 EUR

BSA (Reagent Grade)

30-AB79 Fitzgerald 1 kg 1862.4 EUR

BSA (Reagent Grade)

30-AB81 Fitzgerald 200 grams 571.2 EUR

Tri-RNA Reagent

FATRR-001 Favorgen 100ml 283.2 EUR

Tri-RNA Reagent

FATRR-002 Favorgen 50ml 211.2 EUR

Tri-RNA Reagent

FATRR-003 Favorgen 450ml 774 EUR

Schiff''s reagent

GT3929-1 Glentham Life Sciences 1 113.1 EUR

 

Po izolacji komórek i kolejnym bezpośrednim  RT – PCR z gorącymi komórkami  na urządzeniu, sygnały fluorescencyjne z produktów RT – PCR  dla pojedynczej komórki zostały wykryte i odróżnione od komory nie zawierającej komórek. Wysoce dodatnią zależność liniową (r = 0,9933) zaobserwowano między liczbą komór zawierających komórki a komórkami zawierającymi produkty RT- PCR  od 10 do 400 komórek μl(-1). W ten sposób możliwe było zastosowanie nowej metody  RT – PCR opartej na gorących komórkach do wykrywania eksprymowanego  genu w izolowanych komórkach.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *